目的 构建穿膜肽Arg-EGFP融合基因,进行原核表达及穿膜特性鉴定。
方法 体外合成8个精氨酸的穿膜胎基因片段,将其与EGFP基因通过linker连接,亚克隆入sumo原核表达载体,获得sumo-Arg-EGFP融合基因表达载体。将表达载体转化大肠杆菌, IPTG诱导表达,获得带有sumo标签的Arg-EGFP融合蛋白,并利用sumo蛋白酶切割及Ni-NTA纯化,最后得到成熟的融合蛋白。将纯化后的蛋白与兔角膜细胞共培养,在荧光显微镜下观察其穿膜特性。
结果 成功构建了融合基因原核表达载体,并表达出融合蛋白产物,细胞实验结果显示,融合蛋白能呈剂量依赖性方式转导进入兔角膜细胞。
结论 Arg作为穿膜载体能够在不影响功能蛋白活性的方式下,携带外源蛋白进入角膜细胞。本实验结果将为下一步利用该载体蛋白建立新的给药途径打下基础。 |